金年会|金年会·jinnian(金字招牌)诚信至上-上海巴斯德所揭示宿主细胞中间丝在寨卡病毒感染中的双重作用

2月22日，中国科学院上海巴斯德研究所酒亚明课题组于PNAS上，发表了题为Host cytoskeletal vimentin serves as a structural organizer and an RNA-binding protein regulator to facilitate Zika viral replication的论文。该研究使用多种显微成像技能及组学阐发，初次论述了中间丝波形卵白vimentin于寨卡病毒传染中的物理空间支撑与生物功效调控的两重作用。

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是带包膜的单链公理RNA的黄病毒属病毒，该病毒致使新生儿小头畸形、格林-巴利综合征等神经型疾病。ZIKV进入胞内后会于内质网膜复制，孕育发生年夜量双链RNA、病毒基因组RNA及病毒卵白，这些病毒组分及被挟制的宿主因子一路于核周堆积形成病毒复制工场以提供高效的病毒复制，而该历程中发生猛烈重构的宿主细胞骨架阐扬如何的生物功效尚不清晰。

细胞骨架包括微丝、微管及中间丝，三者互订交织形成收集为细胞内提供机械支撑，介入细胞器定位、物资运输、旌旗灯号传导等主要生物历程。波形卵白（vimentin filaments）属在细胞骨架中间丝，重要缭绕细胞核向细胞边沿辐射状漫衍。最近几年来，有研究发明vimentin filaments于病毒传染中会发生重构向核周堆积，但其于ZIKV传染历程中的动态变化和其生物功效尚不清晰。此外，细胞骨架卵白还有可介入调治胞内转录翻译呆板。然而，中间丝vimentin与胞内转录翻译呆板之间的物理空间及生物功效上的瓜葛尚不清楚，特别于病毒传染环境下，vimentin filaments与病毒复制工场形成的接洽彻底未知。

研究使用共聚焦显微镜、活细胞及时不雅察、超高分辩率显微镜及电镜等生物成像技能，不雅察到跟着ZIKV传染时间的延伸，细胞内vimentin filaments逐渐向核周堆积，形成笼状布局以包裹病毒复制工场组分如dsRNA、NS4B及Env（图1），内源表达病毒卵白Env也能引诱vimentin filaments孕育发生近似的征象。

以往研究报导了vimentin filaments于多种病毒传染中均会呈现近似重构征象，为了进一步探究这一变化的详细意义及机制，科研职员使用CRISPR/Cas9技能敲除了人骨血瘤细胞系U2OS及人肝癌细胞系Huh7中的vimentin后，发明病毒复制工场组分NS4B、Env或者dsRNA的胞内定位由核周堆积变为呈多块分离，并使病毒RNA复制、卵白合成、子代病毒孕育发生量及总体传染率均显著降低。只有于敲除了细胞中回补全长vimentin才能使病毒复制工场于被vimentin filaments的包裹下从头向核周堆积成团，回补只能形成八聚体（unit length of filaments，ULF）不克不及成丝的vimentin不克不及拯救其分离表型。研究发明，ZIKV传染后细胞内另外一中间丝巢卵白（nestin filaments）及波形卵白一路发生了向病毒复制工场堆积的变构，但单敲除了nestin基因其实不影响ZIKV的复制，而单敲除了vimentin影响nestin的表达与病毒复制工场的定位。成果注解，vimentin包管了ZIKV复制工场的高密度核周堆积，是病毒高效传染的须要前提，且其功效于细胞多种中间丝中具有怪异型及主要性。

为了摸索vimentin详细影响了ZIKV病毒传染的哪些步调，研究职员于野生型及vimentin敲除了细胞系中睁开了差别传染时间点试验，以和病毒联合/进入细胞试验，成果发明敲除了vimentin不影响ZIKV联合或者进入细胞，却使病毒卵白堆集量连续低在野生型细胞。为了鉴别这类病毒卵白的降低是合成削减还有是降解增长，研究别离于两种细胞内过表达病毒Env-EGFP及NS4B-EGFP卵白，并别离用卵白合成按捺剂cyclohemide（CHX）、卵白酶体按捺剂MG13二、溶酶体按捺剂NH4Cl处置惩罚，发明vimentin影响病毒卵白合成而非降解。

vimentin filaments正常环境下及ZIKV传染环境下的细胞内定位与内质网高度重合，且敲除了vimentin使内质网漫衍越发扩散，这提醒vimenitn及内质网之间存于主要接洽。研究使用质谱成果举行卵白质组学阐发发明胞内vimentin及年夜量位在内质网的RNA联合卵白（RNA-binding proteins，RBPs）存于互作。进一步RNA测序组学阐发发明，相对于在野生型细胞，vimentin敲除了细胞传染病毒后年夜量内质网相干的具有双链RNA联合功效及转录调治功效的基因表达发生显著下调，这进一步印证了vimentin介入寨卡病毒RNA复制历程。综合两种组学阐发成果，研究聚焦在内质网上一跨膜卵白核糖体联合卵白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1），并使用卵白质体外联合试验（pull-down assay）验证了vimentin及RRBP1彼此作用。2019年，有研究报导了RRBP1能直接联合病毒RNA从而帮忙黄病毒复制，缺掉RRBP1基因使胞内寨卡病毒RNA程度降落约40%。为了剖析vimentin及RRBP1份子于ZIKV传染中的瓜葛，研究于野生型细胞及vimentin敲除了细胞中别离敲低RRBP1基因表达，不雅察二者胞内表达及定位环境，并对于比ZIKV于此中的传染环境。成果发明，缺掉vimentin使RRBP1于mRNA及卵白质程度均降落约50%，且RRBP1及内质网旌旗灯号于胞内定位越发分离，呈现了近似病毒复制工场分离的征象；RRBP1与内质网共定位瓜葛稳定，但RRBP1与ZIKV dsRNA共定位程度显著降落。这申明vimentin对于在ZIKV传染后内质网的邃密变构阐扬主要作用，使病毒复制工场连结致密布局，并堆积其余宿主份子如介入病毒转录翻译的ER相干卵白使其连结高效复制。反之，RRBP1敲低却不影响vimentin的转录翻译程度及胞内定位。零丁敲除了vimentin使病毒复制降落的程度弘远在零丁敲除了RRBP1，且及双敲除了的按捺效率近似，这注解vimentin或者作为RRBP1上游份子调控其介入病毒RNA复制历程。

该研究展现了于遭到寨卡病毒传染后，细胞中间丝波形卵白收集会逐渐向核周堆积形成笼状布局包裹病毒复制工场，会聚主要的宿主因子及病毒组分，与浩繁内质网卵白互作如RRBP1以促成病毒RNA复制，从而同时于物理空间及生物功效上帮忙病毒于胞内形成完备致密的病毒复制工场以促成病毒孕育发生，这提醒vimentin可作为ZIKV传染医治的潜于宿主靶点。

研究事情获得中科院生物物理研究所、份子细胞科学卓着立异中央和芬兰Abo Akademi University科研职员的撑持。

图1.Vimentin filaments缭绕ZIKV病毒卵白形成笼状布局

图2.Vimentin filaments于ZIKV病毒传染历程中作为“布局支撑”及“调治因子”的两重功效

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